研究团队采用染色质相关蛋白纯化结合高分辨质谱分析的策略，成功筛选并鉴定出HSF5作为一种生精细胞染色质相关蛋白。通过荧光共定位实验，进一步确认了HSF5在生精细胞中的特异性核定位模式。研究显示，HSF5 的表达始于早期至中期的粗线期精母细胞，并持续到约圆形精子step4阶段后消失，这表明HSF5可能在减数分裂过程中发挥重要作用。

为进一步探讨HSF5的功能，团队利用CRISPR-Cas9技术建立了Hsf5基因敲除（Hsf5KO）小鼠模型。结果显示，Hsf5KO成年小鼠表现出雄性不育现象，睾丸组织的形态学分析揭示该小鼠的附睾精子缺乏，睾丸管腔内缺少圆形精子和长形精子，并伴随大量生精细胞凋亡。对染色体进行铺展实验的结果则表明，Hsf5KO小鼠的精子发生在中晚期pachynema阶段停滞，且这类停滞的精母细胞在DNA双链断裂（DSB）修复、联会重组及减数分裂性染色体沉默（MSCI）等生物学事件上并无明显异常。这些发现暗示HSF5可能与粗线期后期的生物学事件相关，而不是早期的DSB修复和联会重组过程。

为深入研究HSF5在粗线期中晚期的作用，研究团队利用单细胞测序（scRNA-seq）及Cleavage Under Target & Tagmentation（CUT&Tag）技术进行了多组学联合分析。结果显示，Hsf5KO小鼠的精母细胞停滞在“pachytene-like（P-like）”状态，与野生型小鼠的转录谱相比，P-like精母细胞的粗线期细胞检查点基因（如Wee1、Dmc1和Msh5）表现出显著异常的高表达，这可能导致精母细胞发生凋亡。

结合CUT&Tag数据，研究还发现受HSF5直接靶向调控的基因（如Sycp1、Meiob、Msh4等）也存在异常高表达现象。然而，通过RNA转录动力学分析发现，野生型小鼠的精母细胞在粗线期过程中，Sycp1、Meiob、Msh4等基因的转录逐渐降低，而在Hsf5KO后，这些基因的高水平转录并未显著降低。

此外，HSF5可能与染色质重构复合体的蛋白质如SMARCA5、SMARCA4及SMARCE1相互作用，调控Sycp1、Meiob、Msh4等基因以确保pachynema过程的顺利进行，从而促使pachynema退出进入减数分裂解联会阶段。总体而言，这项研究揭示了HSF5在精母细胞减数分裂pachynema过程中的调控机制，为雄性不育提供了新的分子模型。

在减数分裂的过程中，HSF5与SMARCA5、SMARCA4及SMARCE1等共同发挥作用，抑制部分基因（如sycp1、Meiob、Msh4和Hat1）的表达，而在pachynema的后期，HSF5则直接或间接地促进Hspa2、Ccnb1、Plk1等基因的表达。通过EVO视讯的研究成果，确保精母细胞减数分裂pachynema过程的顺利完成，并为后续的解联会做好准备。

该研究得到国家重点研发计划（2021YFC2700200）、国家自然科学基金（82371613，82301798）、中国博士后创新人才支持计划（BX20230314）、中国博士后科学基金会面上资助（2022M722767）等项目的支持。研究团队成员包括浙江大学医学院附属邵逸夫医院的博士研究生罗春海、硕士研究生徐浩然与刘达琳，以及优秀的团队技术员余梓棋，论文通讯作者为孙斐教授和占军锋博士。

研究为了解雄性不育的机制提供了新的见解，期待未来相关领域的持续深入探讨！